淺析熒光素標記的生物素操作步驟

　　(一)獲得目的基因

　　1、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點)，PCR循環獲得所需基因片段。

　　2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物。

　　(二)構建重組表達載體

　　1、熒光素標記的生物素載體酶切：將表達質粒用限制性內切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切，酶切產物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。

　　2、PCR產物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。

　　(三)獲得含重組表達質粒的表達菌種

　　1、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，根據重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質粒，雙酶切初步鑒定。

　　2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進入下步操作。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。

　　3、以此重組質粒DNA轉化表達宿主菌的感受態細胞。

　　(四)誘導表達

　　1、熒光素標記的生物素挑取含重組質粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養。

　　2、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養基的300ml培養瓶中，37℃震蕩培養至OD600≌0.4-1.0(*0.6，大約需3hr)。

　　3、取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續37℃震蕩培養3hr。

　　4、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻，70℃10min。

　　5、離心12000g×1min，取上清作為樣品，可做SDS-PAGE等分析。